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低温喷雾干燥制备胰岛素缓释微球的试验研究
周伟伟，李保国 （上海理工大学，低温生物与食品冷冻研究所 上海200093）
摘 要：本文采用低沸点溶剂喷雾干燥法制备了胰岛素缓释微球，并从外观形态、粒径分布、包封率、体外释放、热学特性等方面考察了微球的性能。结果表明，胰岛素微球粒径分布较窄，具有较高的包封率，且该方法制备方便、生产效率高，易于实现工业化生产。
关键词：喷干法；微球；胰岛素
微球、毫微球技术是近年来研究最多的药物制剂技术，它具有延长药物作用时间，定向靶位给药，减少药物毒副作用等优点，在现代药物制剂中受到了广泛的应用。作为糖尿病治疗的特效多肽蛋白类药物胰岛素，由于直接口服容易失活并且在血液中的半衰期也很短，患者需要频繁注射治疗，痛苦不堪。人们对于胰岛素微球、毫微球缓释制剂的研究进行了诸多的探索[1]。
目前胰岛素微球主要的制备方法有乳化分散法、凝聚相分离法及界面聚合法等。然而目前的工艺大多存在制备过程繁琐复杂、生产效率低、包封率不能满足实际要求、无法实现工业化生产等而受到了局限。本文采用低沸点溶剂喷雾干燥法制备聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）的胰岛素缓释微球，该法具有生产效率高、影响因素少、不添加乳化剂、成本低、易于实现工业化生产等优点，类似该法已成功制备出清蛋白微球，它将是实现微球工业化最有希望的途径之一[2]。本试验以胰岛素为药物模型考察了低沸点溶剂喷雾干燥法制备的胰岛素微球粒径、包封率及释放等特性，并探讨了产业化的可能性。
1 仪器与试药
UV-2401PC型紫外分光光度仪（日本岛津）；TJL激光粒度仪(上海精密科学仪器公司)；PYRIS Diamond DSC差示扫描量热仪(美国Perkin-Elmer)；微型喷雾干燥机(山东科院天力)；
胰岛素粉（江苏万邦，批号0412A07，30u/mg）；D，L-PLGA(50:50，0.26dL/g，Birmingham， AL 35211-4467)；
2 方法
2.1微球制备
先将一定量的PLGA溶入丙酮中，配成2％(W/V)的聚合物溶液；再按照胰岛素与PLGA成 1:20，1:25及1:30的比例分别混入聚合物溶液中配成A，B，C三组芯壁材混合液；然后将混合液送入微型喷雾干燥机中，在雾化及气流作用下丙酮溶剂得以迅速去除，遂得到了A，B，C三组胰岛素微球，真空干燥2h后于4℃保存待测。喷干机工作参数为：进风温度45℃，空气流量10L/min，进料量60ml/min，风机功率3kW。
2.2微球形态与粒径 ?
使用MOTIC AE31 倒置显微镜400倍下进行观察；微球粒径使用TJL激光测粒仪测定，设定颗粒尺寸按Rosin-Rammler分布。
2.3体外释放测定
2.3.1标准曲线的确定
精密称取一定量的胰岛素，加入磷酸氢二钠缓冲液(pH7.4)后分别配制成0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.10mg/ml、0.12mg/ml的胰岛素溶液，紫外分光光度仪扫描，结果表明214nm处有最大吸收，辅料无干扰。以吸光度(Y)为纵坐标，以浓度(C)作为横坐标，得到标准曲线方程： Y=18.192X-0.0709， r2= 0.9975，线形范围为20～120mg/L。
类似地，精密称取胰岛素后加入人工胃液 (pH1.5)中配成0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.10mg/ml、0.12mg/ml的胰岛素溶液，紫外分光扫描，得到标准曲线方程：Y=23.607X-0.0182， r2=0.9992。
2.3.2释放度测定
每次取约20mg胰岛素微球分散于磷酸缓冲液(pH7.4)或人工胃液(pH1.5)中， 50次/min，37℃恒温振荡，经过不同的时间点取样，然后样品经450nm滤网过滤、5000r/min离心20min后测定其上清液中胰岛素的含量。胰岛素累计释放量可按照以下公式进行计算。
累计释放率=(∑第n次取样时样品的浓度×溶出液体积)/胰岛素总量。
2.3.3包封率测定
收集微粒制备过程中的残留物，加入2ml二氯甲烷，有部分沉淀生成；加入5ml磷酸缓冲液后，漩涡搅拌混合30min，3000r/min离心10min，然后测定其上清液中胰岛素的含量。包封率按照下面公式计算。
包封率=(胰岛素投入量—游离胰岛素的量)/胰岛素投入量。
2.4 DSC差示扫描热分析
对胰岛素载药微球、胰岛素进行DSC测定，样品重约6mg，测试温度0～100℃，升温10℃/min。
3 结果
3.1微球粒径与形态
使用TJL激光粒度仪对制备的胰岛素微球粒度进行测定，结果如图1所示。从图1中可以看到制备的胰岛素微球粒径主要分布于1～12μm范围之间，粒径分布较窄，平均粒径6.58μm，其中92.23%的微球粒径在10μm以下。近年来的研究表明，10μm以下的微粒可以在小肠中吸收，吸收的途径有两条：细胞间隙途径与Peyer小结途径[3，4]。将胰岛素制成口服微球后，一方面防止了胃肠道消化酶与药物直接接触，减少药物活性损失；另一方面提高了胰岛素肝靶向特性，有文献表明尺寸5～10μm的微粒经网状内皮系统吸收后，在肝脏中停留的时间可达35天[5]，这种肝靶向特性改变了胰岛素在体内的组织分布，使胰岛素微粒浓集于肝脏释放，提高了胰岛素口服利用度。
用MOTIC AE31倒置显微镜对胰岛素微球外观进行观察，见图2。使用该方法，在此工艺条件下制备的胰岛素微球，外观较为圆整、均匀，分散也较好，因此能够比较好地满足体内微球制剂的要求。
3.2包封率的考察
本文考察了不同胰岛素投入量对微球包封率的影响。结果表明，当投入的胰岛素与PLGA之比为1:20、1:25、1:30时，包封率分别为62.48%、73.21%与86.48%。在喷干制粒过程中，由于不存在诸如乳液分散法中外水相药物的流失，因此胰岛素理应几乎全部包埋至微球中。然而，可以看到实际情况并非如此，这可能因为未加入乳化剂时，丙酮对于胰岛素的溶解能力有限，随着投入量增加，部分开始逐渐不能够溶解于制备液中，使得胰岛素在喷干过程中不能包入至微球中，导致包封率下降。而当投入量适当减少之后，包封率则有显著的提高，超过了80%以上。当然，胰岛素的投入量也不能过少，1:25、1:30的投入量则较为适合。
3.3体外释药特性的考察
分别以磷酸缓冲液(pH7.4)与人工胃液(pH1.5)为释放介质，对胰岛素载药微球的体外释放特性进行考察。
3.3.1在磷酸缓冲液(pH7.4)中的释放
以pH7.4磷酸缓冲液为释放介质，考察了A、B、C三组胰岛素PLGA微球体外32小时释放曲线，见图3。结果表明， 前2.5h是胰岛素微球的快速释放期，A、B、C三组微球2.5h小时内分别累计释放了47.08%、55.42%与61.02%，虽然这会造成一部分胰岛素的损失，然而对于口服给药也能减少一部分药物开始起效的时间，使胰岛素微球进入体内后能较快地发挥作用；接着微球进入了慢速释放的阶段，在此阶段中，微球的释放情况较好，胰岛素从微球中缓慢地类似线形释放出来直至15h，达到缓慢释放胰岛素的效果；其后，胰岛素微球则更为缓慢地释放达30h后，基本上完成了释药。
3.3.2在人工胃液(pH1.5)中的释放
将A、B、C三组胰岛素微球投入pH1.5的人工胃液介质中，进行前2h释放度的测定，结果如表1所示。
结果表明，不同pH介质对胰岛素的释放具有不同的影响。胰岛素微球在人工胃液中释放的情况要好于磷酸缓冲液，并且突释也较小，从而使得大部分的胰岛素药物能够进入血液循环后再释放。
3.4 DSC差示扫描热分析
对胰岛素及胰岛素微球(胰岛素投入量为1:30)进行DSC差示热扫描分析，见图4。结果表明，包埋至微球中的胰岛素与游离胰岛素具有类似的相变峰，转变温度分别为90.33℃与84.58℃，说明胰岛素没有变性地被包入微球中。另外，图4 (b)中的转变峰小于图4 (a)中的，这可能是由于微球中胰岛素的投入量较少(1:30)而致。
4 讨论
本文采用低沸点溶剂喷干法制备了胰岛素微球，考察了微球的粒度、形态、包封率、体外释放及热物性等特性，并构建了胰岛素模拟给药曲线。糖尿病患者可以在午餐前服药，这时胰岛素释放出现初期释放的高峰，而此时人体中需要分解的糖原也最多；接着药物平缓释放5～10h直至晚餐过后，在夜间的十几个小时至第二天午餐前胰岛素释放的量较少，释放的速率也更为平缓，而夜间与清晨人们的进食量减少，体内血糖也是一天中最低、最平缓的时候，由此可见胰岛素微球的释放比较符合人体生理代谢的模式。
此外，低沸溶剂喷干法制备过程方便、成本节约、生产效率高，配备适当的后处理系统，则容易实现工业化生产。我国糖尿病患者已达到了3000万人以上，并且每年正以超过1%的速度增长，其他各国的情形也不容乐观，据世界卫生组织预测，至2025年后全球糖尿病患者人数将达到3亿人口，因此如何实现胰岛素缓释制剂的工业化发展将会是今后主要面临的问题之一。 参考文献
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[2] 吴祥根，斯陆勤，李高. 清蛋白微球的研究进展[J]. 医药导报，2005，24(1)：51~53
[3] 薛伟明，刘袖洞，雄鹰等. 胰岛素口服给药[J]. 科学通报，2002，47(14)：1044~1049
[4] Jerry N， Anitha Y， Sharma C P， et al. In vivo absorption studies of insulin from an oral delivery system[J]. Drug Delivery， 2001，8(1)：19~23
[5] Damage C， Michel A， Couvreur P， et al. Advantage of a new colloidal drug delivery system in the insulin treatment of streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Diabetologia，1986，29:531.
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