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凝胶过滤法分离蛋白质
【原理】
在含有血红蛋白(Mw=64 500)加入过量的高铁氰化钾(K3Fe(CN)6,Mw=327.25),血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白(methemoglobin,MetHb).为了除去多余的高铁氰化钾,得到较纯的MetHb样品,将上述混合物通过交联葡聚糖凝胶柱,用磷酸缓冲液洗脱,从颜色的不同,可直接观察到MetHb(红褐色)洗脱较快,而小分子高铁氰化钾(黄色)洗脱较慢,达到将MetHb完全分离出来的目的.
【试剂】
1.抗凝全血
2.四氯化碳(CCl4)
3.生理盐水
4.交联葡聚糖G-25(细粒)
5.0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)
6.0.4% K3Fe(CN)6 .
【操作步骤】
1.凝胶准备 称取5g交联葡聚糖G-25,倾入锥形瓶中,加蒸馏水约60ml溶胀,搅动后静置.待凝胶沉积后,用倾注法除去浮于表面的细粒,重复3次.将溶胀后的凝胶用10倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜,以达平衡.
2.装柱 取玻璃层析柱(25cm×1.5cm)一支,垂直装好.加入缓冲液,打开出口,将气泡赶出,关闭出口.然后从管顶向柱内加入缓冲液8cm左右高,将平衡后的交联葡聚糖G-25悬浮液边搅拌边加入柱内,再打开出口,使液体流出,继续不断地加入交联葡聚糖G-25悬浮液,柱内凝胶柱床沉积至高20cm左右时为止.床面上覆盖3ml缓冲液,关闭出口,在凝胶柱面上加盖一层圆形滤纸,使层析柱稳定5～10min后,接储液瓶,打开出口,用2倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡,最后关闭出口.
3.样品处理
(1) 血红蛋白溶液的制备 取草酸盐抗凝全血3ml离心,吸去上层血浆,加入5倍体积的冷生理盐水,混匀后3 000r/min离心5min,弃去上清液,重复洗3次.最后一次吸去上清液后,在红细胞层上面加等体积蒸馏水,振摇.再加1/2体积CCl4,用力振摇3min,3 000r/min离心5min.吸取上层澄清的血红蛋白液备用.此溶液中Hb浓度约为10%(置4℃暂存,一周用完).
(2) 样品 血红蛋白液3滴加K3Fe(CN)6 8滴和蒸馏水2滴混合,制成MetHb混合样品.
4.上样,洗脱 打开平衡好的层析柱出口,使柱内溶液流出至刚露出柱床面时即关闭出口.吸混合物样品0.5ml左右,在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加进样品,切勿搅动床面.然后打开出口,使样品进入床内,直至床面重新露出.同上加入1～2倍样品量体积的洗脱液(这样可以使样品定容至最小,而样品又完全进入床内),当少量洗脱液将流入床面时,加入多量的洗脱液,但注意切勿搅动床面凝胶,连接储液瓶进行洗脱.
5.分部收集 用自动部分收集器,以5滴/min,5min/管的速度进行收集.并且观察柱上的色带,待黄色的K3Fe(CN)6色带完全洗脱下来后,再继续收集两管透明的洗脱液作为空白,关闭出口.
6.测定 将每管收集液加入缓冲液至4ml,混匀,在425nm处测其吸光度,以吸光度为纵坐标,管数为横坐标,绘出洗脱图谱.
【注意事项】
1.装柱后要检查柱床是否均匀,若有气泡或分层的界面时,需要重新装柱.
2.流速不可太快,否则分子小的物质来不及扩散,随分子大的物质一起被洗脱下来,达不到分离目的.
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